在蛋白质尤其是治疗性蛋白药物（如单抗、融合蛋白、酶类等）中，二硫键（Disulfide Bond）是一种维持蛋白质空间结构和功能活性的重要共价键。其连接模式的正确与否，直接关系到蛋白折叠效率、稳定性、免疫原性甚至药效。由于在重组表达和制剂开发过程中，二硫键易出现错配（mispaired）、断裂（cleaved）或重排（scrambled），因此必须通过精准的二硫键映射分析（Disulfide Bond Mapping），确认蛋白质是否形成了预期结构中的二硫键网络。

一、什么是二硫键映射？

二硫键映射指的是通过蛋白质质谱技术，在非还原条件下识别和定位连接两个半胱氨酸残基的二硫键的具体配对模式，并与参考序列或预期结构进行比对分析。

映射的目标通常包括：

1、明确天然二硫键的连接位点

2、鉴定非天然二硫键/错配

3、检测二硫键的重排或缺失

4、进行变异体（variant）筛选与结构表征

二、二硫键映射分析的原理

Step 1：非还原酶解

在保留二硫键的条件下对蛋白进行温和酶解（如胰蛋白酶、Lys-C等），酶解产物中将包含通过二硫键连接的交联肽段。

Step 2：高分辨质谱检测

使用LC-MS/MS技术对酶解产物进行分析，系统可检测到由两个肽段通过一个二硫键连接而形成的“交联肽（disulfide-linked peptides）”，其质量为两段肽质量之和，减去两个氢（−2 Da）。

Step 3：数据库匹配与谱图确认

借助专业的数据库搜索算法（如Byonic、StavroX、MassMatrix等），自动识别交联肽的候选组合，并结合MS/MS碎片谱图手动确认。

Step 4：结构映射与比对分析

将已确认的二硫键配对模式与参考序列进行比对，判断是否存在非天然配对、缺失、重排或聚集诱导结构改变。

三、二硫键映射分析核心技术

1、多酶联合酶解策略（Protease Combinations）

使用胰蛋白酶往往无法覆盖所有二硫键连接区域。通过引入Lys-C、Glu-C等不同位点特异性的酶进行联合酶解，可提高交联肽段的检测概率，实现全覆盖分析。

2、高分辨率质谱平台

分析二硫键交联肽段对仪器性能要求极高，推荐使用如下平台：

（1）Orbitrap Fusion Lumos

（2）Q Exactive HF-X

（3）timsTOF Pro（结合PASEF提升灵敏度）

这些平台可在高质量分辨率下提供更精准的碎片信息，利于解析复杂交联肽。

3、特定离子碎裂技术

（1）CID/HCD（碰撞诱导解离）：适合识别肽段序列；

（2）ETD/EThcD（电子转移解离）：更适合保持二硫键结构，提供链间连接信息，尤其适用于高分子抗体或融合蛋白的结构解析。

4、软件算法支持

目前主流的二硫键分析软件包括：

（1）Byonic：商业软件，支持二硫键搜索模式、高容错性；

（2）pLink：开源软件，灵活配置交联位点和修饰；

（3）Disulfide by PEAKS：结合变异识别与二硫键映射。

四、百泰派克生物科技：精准可靠的二硫键映射分析

百泰派克生物科技结合领先的质谱平台与定制化分析流程，提供高灵敏度、高覆盖率的二硫键映射解决方案，

服务范围涵盖：

• 单抗、双抗、Fc-fusion蛋白
• 生物类似药一致性评估
• IND/NDA申报支持（CQA项目）
• 批间差异和结构变异分析

技术亮点包括：

• 多酶协同酶解 + 非还原策略
• Orbitrap平台高分辨质谱检测
• 专业数据库搜索与人工谱图注释
• 完整的图文报告和法规合规性支持

在结构驱动的生物药开发时代，二硫键映射不仅是质量表征的一部分，更是把握分子稳定性和功能活性的关键工具。科学的分析策略，结合先进的技术平台，是实现高质量蛋白药开发的前提。如您在抗体药物、蛋白工程、生物类似药开发过程中面临结构分析的难题，欢迎联系我们的技术专家。百泰派克生物科技将为您提供从项目设计到分析交付的一站式定制化二硫键映射分析服务。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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