转录因子是一类参与基因转录调控的重要调节因子。不同转录因子的DNA 结合结构域识别不同基因启动子区特定的碱基序列，行使抑制或激活该基因转录的功能。将目的基因启动子区域（通常取转录起始位点TSS 上游-2000bp）、或针对结合位点进行突变、或分段截断序列，构建到报告基因载体luciferase 的上游，共转染转录因子过表达质粒，通过荧光素酶活反映转录因子对启动子活性的调控作用。

图1.转录因子与启动子调控示意图

常用载体：pGL3-Basic 、pGL3-Promoter

图2 .载体信息

翌圣双荧光素酶报告基因检测服务流程

实验步骤

  01

目的细胞质粒瞬转预实验

当选择在目的细胞（而非293 工具细胞）中进行验证实验时，首先要确认目的细胞的质粒瞬转效率，以及摸索合适的瞬转体系，质粒瞬转效率>40%以上时表明预实验通过。

02

目的细胞质粒瞬转预实验

a. 将状态良好，处于对数生长期的空白细胞用0.25%胰酶消化，用完全培养基悬浮成
单细胞悬液，细胞计数后，接种于24 孔培养板中；
b. 培养过夜，观察细胞生长状态。在细胞覆盖率70%左右时，进行转染实验；
c. 转染2 h 前换液为新鲜的培养基；
d. 转染取无菌的1.5 mL EP 管，按照转染试剂使用说明进行转染复合物配置
e. 转染48 h 后收集细胞样品。

03 报告基因检测

§ 

细胞样品收集

a. 转染后从培养箱中取靶细胞，轻轻吸净培养液，PBS 洗涤2 次；
b. 弃去PBS，每孔加入100μL 的1×PLB（5X Passive Lysis Buffer 用无菌水稀释而得）；
c. 细胞裂解后，将样品转移入Ep 管中，-80 度冰箱保存。

§ 

根据报告基因检测试剂盒说明书操作进行检测

§ 

a. 将充分裂解后的裂解产物，10,000-15,000 rpm 离心3-5 min。离心后将上清液移入新的EP 管进行后续检测。

b. Renilla Luciferase Assay 工作液的配置：按照样品要求的量，将Renilla Luciferase Assay Reagent(100×)按照稀释比例加入Renilla Luciferase Assay buffer，混匀后室温放置。

c. 荧光素酶检测：

按照仪器说明书要求将荧光检测打开，设定参数，测定时间为10 s，测定间隔为2 s；将样品按照20 μL 的体积加入测量管中（保持每次样品的加样量一致），另外加入20 μL Firefly Luciferase Assay Reagent 混匀2-3 次（不能漩涡混匀），充分混匀后测定RLU（Relative light unit），同时设置Cell Lysis buffer 为空白对照孔；将检测后的样品，加入20 μL 配制的Renilla Luciferase Assay 工作液混匀2-3 次，充分混匀后测定RLU，同时设置Renilla Luciferase Assay 工作液为空白对照孔。

04

数据处理与分析，计算相对荧光强度

05

提供原始实验数据与完整实验报告

常规检测分组

（1）过表达对照+启动子对照+海肾内参(TK)

（2）过表达对照+启动子野生型+海肾内参(TK)

（3）过表达对照+启动子突变型+海肾内参(TK)

（4）转录因子过表达+启动子对照+海肾内参(TK)

（5）转录因子过表达+启动子野生型+海肾内参(TK)

（6）转录因子过表达+启动子突变型+海肾内参(TK)

实验预期结果

  01

转录因子促进靶基因启动子区转录活性

02

转录因子抑制靶基因启动子区转录活性

翌圣可提供双荧光素酶报告基因检测服务，加快基础研究及药物筛选进度

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